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在探索生命奥秘的征途上，蛋白质-相互作用（PPI）的研究至关重要。传统的BRET（生物发光共振能量转移）技术曾是研究细胞动态事件的有力工具，但其应用却常常受限。
生物发光共振能量转移（BRET）检测试剂盒由Promega在20世纪90年代末开发，对于理解细胞动态事件至关重要，特别是蛋白相互作用（PPI）。在BRET中，发光供体的激发态能量可以转移到受体荧光素，导致受体分子以特征发射波长发出。这些类型的检测试剂盒迅速成为测量PPI的有用工具，它们不仅被认为是通用的、快速的和生物学上有用的，而且也适合用于PPI调节的活细胞药物发现的高通量筛选。然而，传统的BRET技术存在一些局限性：
Promega公司推出的NanoBRET™消除了所有的限制。在NanoBRET™中，可以使用一种新的、效率高得多的供体-受体对来研究PPI（见图1）。这一新组合包括一个非常亮的荧光素酶（NanoLuc）作为能量供体，以及一个用荧光标记的Halotag融合蛋白作为能量受体。 图 1. NanoBRET™检测 A中：使用NanoBRET研究蛋⽩质A和B之间的相互作用。供体是NanoLuc®‑蛋⽩质A融合体，受体是荧光标记的HaloTag®‑蛋⽩质B融合体。 B中：显示了NanoBRET的分离光谱和计算方法。 新的供体（NanoLuc）尺寸小（19kD），发射信号强（460nm发射峰），并且发射光谱较窄，降低了供体信号“溢漏”到受体发射通道的可能性。 选择红色荧光素酶作为BRET配体 (618nm发射) 通过共价键连接到HaloTag，这允许相当大的光谱分离（超过150nm），从而确保非常高的信噪比。 然而，尽管比典型的BRET检测方法优越，NanoBRET的性能仍然取决于选择合适的酶标仪。Promega强烈建议使用能够测量双滤光片波长的仪器，Thermo Scientific Varioskan LUX多功能酶标仪具备测量双滤光片波长的能力，非常适合进行NanoBRET™检测。 选择次优滤光片可能会损害试验性能并降低数据质量。根据Promega的说法，理想情况下供体信号应该用中心波长为460nm的带通滤光片（BP）和一个从600-610nm开始的长通滤光片（LP）来测量，以收集所有受体发射信号。使用适当的LP滤光片收集受体信号对于确保检测试剂的灵敏度尤为重要。 96孔板和384孔板，1X PBS/0.1%BSA，NanoBRET™控制蛋白组，NanoBRET™ Nano-Glo®底物。 用1X PBS/0.1%BSA稀释NanoBRET Nano-Glo底物，稀释250倍制备成2X溶液。将不同浓度的反应液每孔加50µl，并加入等量的2X NanoBRET Nano-Glo底物 (50µl)。最后一种试剂用Varioskan LUX添加。在加入底物后10分钟内，使用Varioskan LUX和选择的滤光片检测供体和受体发射光信号。 仪器启动前，需要安装适当的滤光片。为此，请按照仪器手册中的说明将滤光片安装到Varioskan LUX中。需要注意的是，在安装F600LP或F610LP滤光片时，即使这些滤光片没有波长范围，也必须在Thermo Scientific SkanIt™软件中定义一个波长范围，可以设置600-999nm。 添加一个动力学环，选择总时间（或读数次数）和动力学间隔。在此测试中，以1分钟为间隔进行20次读数。注意：反应开始后的前10分钟内，受体和供体发射信号的动力学衰减非常显著（如图2所示）。然而，供体和受体信号的衰减速度保持不变，因此在较长的测量时间内计算出的NanoBRET比值不会受到影响。 图2 在本次案例中，在读数为1时用中高速自动分液50µl NanoBRET Nano-Glo底物。 选择用于测量NanoBRET的滤光片对，并设置1000毫秒的测量时间，使用自动增益。 注意：通常情况下，改变增益以增强受体发射信号并不能改善NanoBRET结果（改变增益会同时放大信号和背景噪声）。然而，在受体发射信号饱和的情况下，可以降低增益以获得非饱和读数。 在0%浓度（没有nanoBRET信号）和100%浓度（最大nanoBRET信号）的孔中测量受体和发射光谱。使用波长范围为400–700nm（以1nm步进），测量时间为100ms。 通过将受体发射信号值除以供体发射信号值（Acceptor Em/Donor Em）来计算每个样本的NanoBRET比值。 通过从样品中减去对照（无相互作用）的NanoBRET比值来计算校正后的NanoBRET比值。 对校正后的 NanoBRET 比值与浓度的依赖关系进行线性回归分析，并计算曲线的斜率。 如果仪器正确地检测到NanoBRET信号，应该获得一条线性曲线。使用以下公式计算定量限（LOQ）和检测限（LOD）。注意：无相互作用对照（下图）对应于0%浓度样本。 使用NanoBRET比值的均值和标准差来计算每个浓度筛选窗口系数值（Z’）以评估该检测方法在各个浓度下的性能： 使用Promega控制蛋白组进行的NanoBRET检测显示，在96孔板中，使用两种不同的发射滤光片收集受体信号时，Varioskan LUX 检测到的NanoBRET信号保持线性（图3）。 图3 当使用波长为600或610nm滤光片收集受体信号时，仪器性能指标LOQ和LOD值也高度相似（表1）。使用Varioskan LUX，两种情况下的LOQ浓度都在0.2%左右，表明相对于总供体群体，含有0.2%供体受体（BRET）对的样本从统计上与只含有供体分子的样本区分开来。 NanoBRET是一种出色的筛选工具。根据这里获得的结果，还可以得出结论：在1%最大NanoBRET效率下进行筛选优化，无论Varioskan LUX测量时采用哪个NanoBRET受体发射滤光片（600或610nm），都可以产生极好的质量参数（Z' > 0.8）。 当在384孔板中运行时，该分析方法也表现良好。在这种情况下测量的最低检出限 (LOD) 只轻微增加到0.35%(图4)。这使得NanoBRET和Varioskan LUX的结合对于大型化学抑制剂筛选受体供体对的检测非常有用。 图4 在Varioskan LUX中选择多重化学发光检测滤光片，可实现NanoBRET 的性能，这是一种由Promega开发的技术，非常适合对活细胞中的蛋白质相互作用进行动态研究。我们建议使用中心波长约为460nm（发射波长为450nm，带宽为80nm）的带通 (BP) 滤光片测量供体发射信号，使用起始波长为600或610nm的长通 (LP) 滤光片测量受体发射信号。
