为何要检测内毒素 图片

为内毒素无处不在

内毒素又称为脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，分子量范围为3,000至4,000Da，由长链复合多糖尾部和疏水脂质基团组成（图1）），是大多数格兰氏阴性菌细胞壁的组成部分，具有较高的热稳定性。当细菌在活跃生长或在死亡分解时，细胞壁中的脂多糖就被释放到周围环境中。

图1.脂多糖结构。内毒素为复合脂多糖，是革兰氏阴性细菌细胞壁的活性结构成分。它们由核心寡糖链、O-特异性多糖侧链（O-抗原）和脂质组分（脂质A）组成。

使用如大肠杆菌(E.coli)生产的重组蛋白，或者提取革兰氏阴性菌内的核酸时经常遇到内毒素污染问题。内毒素污染的蛋白质/抗体/核酸在转染入细胞中或者注入到动物体内时，可引发强烈的免疫反应，导致全身性炎症反应综合征（SIRS）和/或败血症。因此，内毒素的去除对于人类疾病治疗的注射型药品、生物制品等都是必须的，尤其对于基因药物、蛋白药物、抗体药物、疫苗等生物制品的下游纯化处理来说就显得非常重要。

中国药典的规定

细菌内毒素检查法（通则 1143）包括两种方法：凝胶法和光度测定法，后者又包括浊度法和显色法，可以选用其中任何一种方法进行细菌内毒素检查。凝胶法和光度法各具优点和局限：

凝胶法

凝胶法的优点是操作简便，供试品在排除干扰作用后均可使用凝胶法进行检验。

凝胶法的干扰试验是确定供试品能否使用凝胶法的决定因素。进行干扰实验时，应挑选与鲎试剂反应呈阴性的样品进行干扰试验。若样品稀释到 MVD(有效稀释倍数) 仍不能排除干扰作用，应进一步对供试品的前处理进行研究，再用干扰试验验证能否使用凝胶法。

光度法

光度法（包括浊度法和显色法）可定量检测内毒素的含量，能较为准确评估产品在生产过程中污染的相对风险，定量检测的数据不仅有利于追踪产品质量趋势，还能起到风险预警的作用，更易达到数据完整性的要求。

由于光度法的检测限范围比凝胶法宽，使得有干扰的样品可以有更大的稀释倍数，对于部分使用凝胶法无法排除干扰的样品，可以尝试使用光度法建立细菌内毒素检测方法。

常用实验方法和干扰分析

鲎试剂是从海洋动物鲎提取的血细胞溶解物,是检测革兰氏阴性细菌内毒素的一种敏感试剂。其实验原理如图2所示：

图2.鲎试剂的级联反应。LPS（内毒素）激活质膜结合因子C。活化的因子C激活因子B，活化的因子B激活凝固酶原，生成凝血酶。加入显色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA后，活化的蛋白酶-凝血酶催化对硝基苯胺（pNA）的释放，产生黄色。通过测量405nm处吸光度值进行定量。根据标准曲线可推算得出结果。红色表示无活性酶，绿色表示活性酶。

通常实验流程：

Thermo提供光度法内毒素定量试剂 (A39552）。那么试剂的品质如何？我们将从灵敏度、数据重复性、抗干扰性等几个角度对Pierce内毒素定量试剂盒的性能进行验证：

数据灵敏度和重复性

提供两个线性动态范围：0.01-0.1 EU/mL和0.1-1.0 EU/mL（图3）。使用此试剂盒的实验-实验和操作者-操作者差异系数（CV）为3%。灵敏度高可以有效地避免内毒素定量中潜在的假阴性或者假阳性。

图3.Pierce内毒素定量试剂盒的标准曲线。标准曲线显示出优异的线性度，r2= 0.99。Pierce显色法内毒素定量试剂盒的较低标准曲线范围为0.01-0.1 EU/mL。0.1–1.0 EU/mL标准曲线表示使用内毒素标准品和阿米巴样细胞裂解物培养14分钟，随后使用显色底物培养6分钟。对于较低浓度，使用内毒素标准品和阿米巴样细胞裂解物培养30分钟，随后使用显色底物培养6分钟。低浓度标准品（0.01-0.1 EU/mL）显示出了一致性和再现性（n = 17；CV = 3%）。

兼容性

鲎试剂可能受许多因素影响，造成假阴性或假阳性。包括：

i. 反应温度、样品酸碱度、离子强度和金属离子（如镁和钙）

ii. 血清蛋白、核酸、脂肪酸、表面活性剂和螯合剂（如EDTA和肝素）可引起内毒素分子结构的变化

iii. (1-3)-β-D-葡聚糖的非特异性干扰：鲎试剂会与其反应，造成假阳性结果

表1.使用Pierce显色法内毒素定量试剂盒，获得有效内毒素检测结果所兼容的高浓度。所列出的浓度是指样品中添加0.5 EU内毒素时，未使定量值降低的实际浓度。以比例的形式表示稀释浓度，其中1:100表示100倍稀释

需要指出的是：Pierce显色法内毒素定量试剂盒（货号A39552）与β-葡聚糖兼容，并且在含有10ng/ mL（1,3）-β-D-葡聚糖的样品中，未显示出增强作用。

内毒素去除

超滤、多粘菌素B亲和树脂以及基于树脂或膜的色谱法是内毒素去除的传统方法，这些方法在蛋白回收率、内毒素结合能力等方面具有局限性，有的甚至本身具有毒。

Thermo Fisher Scientific提供高载量内毒素去除树脂(88270)，是基于ε-聚赖氨酸亲和树脂（天然赖氨酸的聚合物），显示出内毒素结合能力和蛋白质回收率：

➤ 结合力可以达到2,000,000 EU/mL

➤ 在处理初始内毒素水平为10,000 EU/mL的样品时，去除效率可以达到99%以上

图4.采用Pierce高通量内毒素去除树脂去除内毒素的效率。（A）内毒素去除和定量的工作流程。（B）测定和去除蛋白质样品中的内毒素以备下游应用。