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跨膜蛋白在细胞内外物质交换和信息传递中起着关键作用，是细胞维持正常生命活动及对环境信号做出响应所必需的。许多跨膜蛋白的生理功能依赖于与特定配体分子的相互作用。因此，探究跨膜蛋白与配体分子识别和结合的机制一直是生物学研究的重点课题。从头设计能够结合特定配体分子的跨膜蛋白，是蛋白质设计领域的重要目标之一。实现这一目标不仅在生物传感、分子检测等生物学工具的研发领域具有巨大应用潜力，还能深化我们对跨膜蛋白与小分子配体相互作用机制的认识，意义重大。
然而，由于膜环境与膜蛋白本身的复杂性，膜蛋白在表达、纯化和表征上面临诸多挑战，导致其在蛋白质结构数据库（PDB）中的结构数量相对较少。人们对膜蛋白折叠、定位和功能机制的理解不如水溶蛋白深入，因此跨膜蛋白的从头设计难度更大。由于小分子结合蛋白的从头设计问题尚未完全攻克，再加之跨膜蛋白骨架采样的局限性以及在疏水性膜环境中构建空腔和极性相互作用等挑战，使得精确设计能够特异性结合指定配体的跨膜蛋白成为一项悬而未决的难题。 北京时间2025年2月20日，西湖大学未来产业研究中心、生命科学学院、西湖实验室卢培龙课题组，在Nature杂志在线发表题为De novo design of transmembrane fluorescence-activating proteins的论文，首次实现了跨膜荧光激活蛋白的从头设计，这也是第一个通过人工设计得到的能够非共价结合特定小分子的跨膜蛋白。 在这项最新研究中，研究团队使用 Rosetta 软件进行序列设计和优化，结合 AlphaFold2 进行结构预测和验证。首先设计了一个稳定的四螺旋束结构的水溶性荧光激活蛋白（wFAP），该蛋白具有一个中央口袋，能够结合并激活荧光配体（HBC599），其中 wFAP1.1 和 wFAP1.2 变体表现出较高的荧光激活能力和结合亲和力，与 HBC599 的亲和力达到纳摩尔级别，使其荧光亮度激活超过 1600 倍，结合态的亮度和量子产率均优于常用的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。 在 wFAP 的基础上，研究团队通过重新设计表面氨基酸残基，将其转化为跨膜蛋白，同时尽量减少对配体结合口袋结构的扰动。使用 ColabDesign 框架进行跨膜序列的生成，结合AlphaFold2 进行结构预测和优化，从而设计出了跨膜荧光激活蛋白（tmFAP）。其中，tmFAP1.2 变体表现出最高的结合亲和力和量子产率。冷冻电镜结构验证显示，这些蛋白的结构与设计模型高度一致。研究团队还在活细菌和真核细胞中表达了这些设计的 tmFAP 蛋白，结果显示，这些蛋白在细胞中表达后会自发定位到细胞膜组分中，并能够特异性激活荧光配体（HBC599）的荧光，且在膜环境中表现出较高的亮度和量子产率。 该研究采用深度学习方法，解决了设计跨膜区时引起的核心结构及配体结合口袋结构扰动问题，实现了小分子结合跨膜蛋白的精确设计，为跨膜蛋白的从头设计提供了新范式。该方法使小分子结合跨膜蛋白的设计不再依赖天然蛋白骨架，且可针对任意小分子进行设计，为定制化功能的跨膜蛋白从头设计奠定了基础，如转运体蛋白及配体门控离子通道等。此外，可以沿用设计 tmFAP 的思路，进一步开发可遗传编码的生物探针。在膜蛋白穿膜区设计荧光化学探针结合位点，使其响应膜两侧的物理或化学信号。这种生物探针不仅具有膜蛋白可控表达的组织和位置特异性优势，还兼具化学探针的高灵敏度和高信噪比特性，在检测跨膜电压和 pH 梯度等方面具有广阔的应用前景。 在本研究中，使用了Implen Nanophotometer® N60用于跨膜荧光激活蛋白tmFAP的浓度测量，以通过公式计算相对荧光单位RFU值，获得tmFAP的荧光表征。Nanophotometer®采用的样品压缩法，无需依赖于样品的表面张力，在检测过程中无需形成样品液柱，特别适合于测量膜蛋白的浓度（含去垢剂样品），广泛应用于（膜）蛋白结构生物学研究领域，如纳米盘构建及冷冻电镜样品浓度定量。新的科研成果，总有Implen的身影，Nanophotometer® - 蛋白质科学研究的好伙伴。
