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    技术干货:一文读懂菌液OD600测量

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        微生物和细胞生长的光密度(OD)测量是微生物学及生物发酵实验室中最常用的方法之一,用于在进行蛋白表达或监测培养过程时确定收获的最佳时间。细胞、细菌或酵母在液体培养基中的生长情况(细胞密度、细菌生长、酵母生长)通常通过测量600nm下的光密度(OD600)来获得。OD600测量通常用于确定细菌培养物的生长阶段,这些测量有助于确保在适当的细胞密度下收获细胞。

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        由于OD600测量的光密度是由光散射而非光吸收引起的,因此细胞的大小和形状以及死细胞和碎片可能会增加光散射。因此,当在相同的仪器上测量时,处于相同密度水平(如Cells/mL)的不同细胞类型可能显示出不同的OD600值。

        细菌细胞的生长通常经历一系列连续的阶段,包括滞后、对数、静止和衰退。通常,应在对数期结束时收获细胞,使用样品的光密度OD600来确定何时达到这一时间点,是非常便捷的。在诱导或收获之前,细胞通常常规生长至OD600达到约0.4。

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    朗伯-比尔定律与OD600


        朗伯-比尔定律,根据经验将光的吸收与样品的浓度联系起来。该定律表明,光通过特定样品的透射率(T=I/Io,其中I=出射光,Io=入射光)、特定化合物的消光系数(ε)、样品中具有光吸收的物质的浓度(c)和光传播的距离(d)之间存在对数关系。根据朗伯-比尔特定律,OD值与细菌浓度(C)或数量(N)具有类似的定义。然而,OD600的测量实际上是浊度的测量,因此,我们可以应用朗伯-比尔定律定律,但需要进行一些额外的考量,如样品浊度(浓度)的适用范围,设备收集非散射光的结构等。


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    OD600读数的差异


        对于混浊的样品,如细胞培养物,测量的吸光度的主要来源于光散射,而不是完全遵循朗伯-比尔定律中的分子吸收的原理。因此,测量取决于分光光度计的光学设置(比色皿和仪器出射狭缝狭缝之间的距离、单色器的性能、狭缝几何形状等),不同的仪器类型很可能会为相同的混浊样品提供不同的OD 600读数。因此,如果要比较不同分光光度计的结果,则必须首先使用两种不同仪器上的相同样本进行OD600值比较,并进行相关性的归一化。


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    OD600校正值公式


        NanoPhotometer®或OD600 DiluPhotometer™等仪器默认“校正系数”为1,如使用相应方法进行调整,将有助于在不同设备之间提供可比较的结果。


    OD600校正因子= 设备1测量值 / 设备2测量值


        或者使用创建适当的校准曲线来采用更精确的方法,可以通过在不同浓度范围内比较测量的OD600与预期的OD600来构建校准曲线。预期的OD600是通过使用替代技术(例如显微镜载玻片法)进行细胞计数,并使用经验法则将1个OD600=5×108个cells/ml的大肠杆菌联系起来。


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        通常建议使用试管或比色皿进行OD600测量,以确保读数的稳定性,较大体积样品提供了更大的浊度平均值,误差相对较小。此外,为了防止菌体沉降过快,并给出随时间变化的OD读数,可向样品中添加甘油。对于一些很小的样品量要求,使用微滴进行测量,也是可行的,特别是NanoPhotometer®的样品压缩法,在液膜中测量,可避免液柱中显著的沉降现象。但需注意在上样前样品的充分混匀。

     

        用于测量的仪器的线性范围对于覆盖培养物的整个生长周期至关重要,建议至少2.5 OD的OD限值以提供足够的工作范围。如果存在大量的死细胞,使结果模糊不清,则样本可能在整个范围内不是线性的。如果样品仍然超出范围,则可能需要稀释;应仔细选择参数以覆盖整个所需区域,而不影响测量的线性度。


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        为了减少OD600测量所需的体积,并避免耗时且容易出错的手动稀释,可以使用特殊的比色皿。Implen的DiluCell™自动稀释比色皿可降低样品体积要求,并提供自动虚拟样品稀释。由于DiluCell™的独特设计,光路从标准的10毫米减少到1毫米(DC 10)。根据朗伯-比尔定律,光程因子为10。使用DiluCell™自动稀释可节省时间,并排除稀释误差和交叉污染。


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        德国Implen提供多种OD600测量解决方案,包括应用于基础测量和高级工艺开发的不同机型,具有可靠的测量结果和丰富的软件功能,以及合规性功能,能够充分满足不同用户的需求。OD600测量,认准德国Implen。


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